piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells | Protocol (Translated to Chinese)
From:
October, 20062006Oct.Nov.Dec.20062007Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20072008Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20082009Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20092010Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20102011Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20112012Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20122013Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20132014Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20142015Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20152016Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20162017Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20172018Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20182019Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20192020Jan.Feb.Mar.Apr.May2020 Until:
Today2006Oct.Nov.Dec.20062007Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20072008Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20082009Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20092010Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20102011Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20112012Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20122013Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20132014Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20142015Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20152016Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20162017Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20172018Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20182019Jan.Feb.Mar.Apr.MayJun.Jul.Aug.Sep.Oct.Nov.Dec.20192020Jan.Feb.Mar.Apr.May2020

Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.


We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.


This is a sample clip. If you re new to JoVE sign up and start your free trial today to watch the full video! If your institution has an existing subscription, log in or sign up to access this video.
Related JoVE Videos 利用视网膜成像研究痴呆 thumbnail

利用视网膜成像研究痴呆
Published 11/06/2017

酶活化致癌物和药物对共价 DNA 加合物的生成体外及其对32 P-postlabeling 的测定 thumbnail

酶活化致癌物和药物对共价 DNAup>对32 P-postlabeling 的测定
Published 3/20/2018

环境细颗粒物小鼠组织中三种 DNA 损伤的质谱定量及水平评价 thumbnail

环境细颗粒物小鼠组织中三种 DNA
Published 5/29/2019

美国锥虫从男性和女性到天真的命运的性传播 thumbnail

美国锥虫从男性和女性到天真的命运的性传播
Published 1/27/2019

Replay

The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloADIng the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.

If that doesn't help, please let us know. UnABLe to load video. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help. An unexpected error occurred. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
Cite this ArticleCopy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Saha, S., Nakazawa, Y., Huye, L. E., Doherty, J. E., Galvan, D. L., Rooney, C. M., Wilson, M. H. piggyBac TraNSPoson System Modification of Primary Human T Cells. J. Vis. Exp. (69), e4235, doi:10.3791/4235 (2012).


Abstract

piggyBac转座子系统自然是积极的,最初来自甘蓝尺蠖蛾1,2。质粒基于此非病毒的系统,是最常用的利用两个质粒与表达一个的piggyBac转座酶和转座子的质粒转染的基因(s)之间的反向重复元件所必需的基因转移活性景点PiggyBac转介导的基因转移通过“剪切和粘贴”机制转座整合到基因组中的目标小区(s)的权益。转座子段PiggyBac转已表现出高效率的基因转运活性在多种昆虫1,2,哺乳动物3-5,和人cells6包括初级人类T细胞7,8。近日,“恨铁不成钢”的座子转座产生,提高转基因效率9,10。

人类T淋巴细胞的临床欢迎有兴趣过继免疫治疗癌症的11日。值得注意的是,第一次临床试验涉及使用睡美人转座子系统的人类T细胞的转座子修改已批准12。我们先前已经评价piggyBac的人类T细胞的遗传修饰的非病毒方法的效用。我们发现piggyBac转是高效率的在带记者基因和非免疫原性诱导的自杀基因7的人类T细胞的遗传修饰。基因组的整合位点的分析,揭示了缺乏或称为原癌基因附近的偏好整合到13。我们使用piggyBac转基因修改细胞毒性T淋巴细胞,以进行针对肿瘤抗原的HER2的嵌合抗原受体,并发现,基因修饰的T细胞介导的有针对性的杀害在原位小鼠模型的HER2阳性肿瘤细胞在体外和体内 14。我们也使用座子以产生耐雷帕霉素的人类T细胞,这应该是有用的癌症疗法,其中雷帕霉素是利用15。

在这里,我们描述了使用座子基因修饰初级人类T细胞的方法。这包括分离的外周血单核细胞(PBMCs)培养,基因修饰,和活化的T细胞随后从人类血液。对于本报告而言,T细胞进行了修改与一个报告基因(EGFP)基因表达的流式细胞仪分析和量化。

PiggyBac转可用于与感兴趣的基因的各种修改的人T细胞。虽然我们已经使用piggyBac转指示T细胞对肿瘤抗原14,我们也使用piggyBac转添加诱导型安全开关,以消除基因修饰的细胞,如果需要7。大货的piggyBac的能力,也使转基因的大雷帕霉素抗mTOR的分子(15 KB)15。因此,我们提出了一种稳定的基因改性的初级人T细胞,用于各种各样的目的的非病毒方法。

Protocol

0天

1。从人血中分离单核细胞

收集20毫升的人新鲜血液,使用静脉穿刺到的Na-肝素的真空采血管管。 混合血液和高级的RPMI 1640,在1:1(体积/体积)的比例。 加入到50ml离心管中(25℃)的20毫升淋巴制剂介质。慢慢层25-30毫升血液RPMI 1640混合的lymphoprep顶部。 在400 XG离心40分钟,没有踩刹车。 收集到10毫升的1×PBS(25℃)用一次性移液管的两个不同的和模糊的层,使体积达50毫升用1×PBS。 离心450 xg下10分钟。 完全吸出上清液,加入20毫升的高级RPMI 1640。 400×g离心5分钟离心。 吸取上清液。在37℃下预热5纳克/毫升的rhIL-15的完整的T细胞的培养基中加入10毫升计数的细胞的数量和板在24孔组织培养外套编板上,在2×10 6细胞/孔的完整的T细胞的介质补充有5纳克/毫升的rhIL-15添加无菌水对周围井。孵育过夜可增湿培养箱中在37℃下,5%CO 2。

第1天

2。涂层板的抗-CD28和抗-CD3抗体的刺激T细胞

稀释在无菌水中的抗-CD28和抗-CD3抗体的浓度为1微克/毫升每个。 加入500μl每种抗体溶液5标记非涂覆的组织培养的24孔板的孔中。 添加无菌水休息的井。包装板的收缩包装,并在4℃冰箱中。

3。未刺激T细胞的核转染的

Prewarm T细胞介质,在37°C和5 ng / ml的重组人IL-15的补充。准备完整的nucleofector的解决方案,通过添加500微升至2.25毫升的Nucleofector解决方案的Nucleofector补充1。 一liquot 5微克每个座子(Zeo的-的pT-CMV-eGFP的)和转(在1.5毫升微量离心管中的pCMV-piggyBac转 )。 注意:这可能是必要的,以优化为最佳的基因传递转座酶和转座子的DNA量,并尽量减少的细胞毒性。质粒可以从作者获得请求。 入50毫升的管的24孔组织培养板中收获的PBMC。计数细胞的数目。下次作为流式细胞仪的控制中使用的2×10 6细胞。 7-10×10 6个细胞加入到一个15毫升的试管,在400×g离心5分钟离心,吸出上清液和手指轻拂颗粒。 T细胞完整的核转染的解决方案松开细胞沉淀中加入100μl。 添加的溶液细胞混合物的管含有质粒。 加入细胞质粒的溶液的混合物的核转染反应杯底部。要小心,不要实施任何气泡。 Nucleofect使用专业的细胞克U-014(未刺激T细胞,人力, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ )的。 立即加入500μl预热的媒体与重组人IL-15的比色皿。将细胞转移到24孔平板的孔中,与1.5毫升预热的媒体与rhIL15。 孵育过夜可增湿培养箱中在37℃下,5%CO 2。

第2天

4。非特异性刺激T细胞

收获细胞,并确定手机号码。设置留出0.5×10 6个细胞的流式细胞仪来确定的GFP阳性细胞的频率。使用的非转染的外周血单个核细胞作为对照。 吸干CD3/28抗体溶液从非组织培养涂板,并与T细胞介质冲洗各孔。 。重悬nucleofected的细胞以0.5×10 6个细胞每毫升中完整的CTL媒体补充有5纳克/毫升的rhIL-15。加入2.0毫升每个的nucleofected 4非组织培养板的孔中的细胞。加入0.5×10 6个的非nucleofected细胞的第 5以及。 孵育3天可增湿培养箱中,在37℃,5%CO 2。

第5天

收获的刺激的T细胞的未涂覆的组织培养板中。 计数和replate细胞在24以及涂覆的组织培养板中,在0.7×10 6细胞/ ml在与5 ng / ml的IL-15的T细胞介质。

7天

7。基因表达分析

收获细胞和染色用抗人CD8抗体(也可以使用抗-CD3和抗-CD4)和%GFP表达的流式细胞仪分析。

第8天(可选)

8。扩大T细胞

在转染后的第8天,T细胞可以在T再铺平板在密度为0.7×10 6个细胞每孔的进一步扩大16与IL-15的细胞培养基。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

遗传修饰与报告基因(绿色荧光蛋白)的人T淋巴细胞中的步骤的示意性展示图1中所示。这些质粒可根据作者的要求。展示的步骤与报告基因(EGFP)转基因人类T淋巴细胞是一个schemtic舒如图2所示。激活T细胞,以获得它们分裂,扩大和传播文化,这是必要的。修改人类T细胞,然后培养,并用流式细胞仪分析的第1天,7天的基因表达。所示的结果在图3中从一个供体细胞进行染色,用Cell Quest软件与别藻蓝蛋白(APC)标记的抗-CD8,由FACSCalibur配备的过滤器组4的荧光信号的eGFP(转基因)和APC荧光分析(Becton Dickinson公司)。我们先前已观察到CD4和CD8阳性T细胞的基因修饰,和本文中妖strate作为一个实施例7中的 CD8阳性细胞。虽然我们分析为单一的转基因表达这里,piggyBac转也被用于在人类细胞中17(或复用)的多基因的基因转移。 eGFP表达在第1天,第7天之间的减少可能是由于这一事实,并非所有的转染的细胞进行转座子的DNA稳定整合。

图1
图1示意图用于piggyBac转的人T细胞介导的基因修饰的质粒。 CMV,巨细胞病毒启动子,内含子,SV40内含子的mRNA的稳定; piggyBac转 ,转座的CDNA; SV40 pA的,多聚腺苷酸化的网站; pUC的,复制原点;β-内酰胺酶,氨苄青霉素抗性基因; PB3 IR,piggyBac的 3 倒位重复; PB5 IR中,piggyBac5 反向重复; ZeoR,Zeocin抗性基因,复制原点; R6K大利,“个人游”,插入序列,绿色荧光蛋白,荧光报告基因。 注:抗生素被用于细菌的选择和成长,但都没有使用在T细胞的培养。 查看大图 。

图2
图2描述的变形例使用piggyBac转座子系统的初级人T细胞的示意图 。

图3
图3在T细胞中的表达。稳定的转基因修改的piggyBac转座子系统·米。左图:在第1天的绿色荧光蛋白表达。右图 ​​:绿色荧光蛋白的表达第7天。 点击此处查看大图 。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

本文所描述的方法,使稳定的转基因修饰的初级人T淋巴细胞。我们之前测试过的piggyBac转座子系统的使用,修改T细胞表达的报告基因(超过4周),一个非免疫原性自杀的基因,过继免疫治疗的嵌合抗原受体(超过100天),工程师免疫抑制药物的抗7,13-15。非病毒的T细胞过继免疫治疗和其他应用程序的修改应该是更便宜,因此,更广泛地利用比逆转录病毒转导。新的过动座子元件的使用应增加稳定的转基因修饰的人T细胞制造的可行性。虽然这里没有描述的,一个可以实现必要的潜在的临床应用的稳定转染的T细胞的数目。利用piggyBac转介导的基因转移和AK的组合562(人工抗原呈递)饲养细胞,约2×10 6稳定转染的T细胞的初始屈服可以扩大至超过10 10转导的T细胞在4〜5周,并在6至7至10 12 4至5日志周7。在人类T细胞的座子整合位点分析显示,没有偏向原癌基因,但是,它没有表现出偏爱融入活化的T细胞中高表达的基因时使用的核转染技术,上面列出13。 座子是一个很有前途的方法稳定遗传修饰的人类T细胞为各种各样的应用。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

SS支持到研究生培训津贴由霍华德休斯医学研究所医学通过TBMM计划的一部分。 MHW是支持的,部分的职业发展奖的博士和夫人的Harold M. Selzman从退伍军人事务部的大力支持。也支持这项工作是由美国国立卫生研究院淋巴瘤SPORE授予P50CA126752和NIH R01 DK093660。

Materials
Complete T cell media composition
1x Advanced RPMI 1,640
5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum
2 mM GlutamaxIM-I

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.


A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.


We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.


To watch full video,login or sign up! If your institution is subscribed to the section, you can access that content off-site by login or signing up with your institutional email.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.


Your institution must be subscribed to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Please, fill out the form below to receive a free trial


Please input your email address below and we will manually send you an email to verify the address.

Email:
A verification has been sent to .
Please check your email and follow the link to activate your . Can't find your verification email? RESEND EMAIL